ГлавнаяПолевые испытанияМолекулярно-генетические механизмы действия новых биостимуляторов

Статьи



 

Молекулярно-генетические механизмы действия новых биостимуляторов

 

С.П. ПОНОМАРЕНКО1, В.А. ЦЫГАНКОВА2, Я.Б. БЛЮМ3, А.П.ГАЛКИН3, В.Т.САБЛУК4

 

1. МЕЖВЕДОМСТВЕННЫЙ НАУЧНО - ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ЦЕНТР «АГРОБИОТЕХ» НАН И  МОН УКРАИНЫ. 02160, г. КИЕВ, ХАРЬКОВСКОЕ ШОССЕ, 50,

e-mail: Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра. .

2. ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ И НЕФТЕХИМИИ НАН УКРАИНЫ.

г. КИЕВ-94, МСП-660, 02660, ул. МУРМАНСКАЯ, 1,

e-mail: Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра. .

3. ИНСТИТУТ ПИЩЕВОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ И ГЕНОМИКИ НАН УКРАИНЫ.

УКРАИНА, 04123, г. КИЕВ, ул. ОСИПОВСКОГО, 2А,

e-mail: Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

4. ИНСТИТУТ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ  УААН,  г.КИЕВ,  ул., КЛИНИЧЕСКАЯ, 25

 

Цель:   Установить молекулярно-генетические механизмы повышения устойчивости растений сахарной свеклы и яровой пшеницы к патогенным организмам.

Методы: Исследовали растения сахарной свеклы Beta vulgaris L., инфицированные цистообразующими коренепаразитирующими нематодами Heterodera schchtii, а также растений яровой пшеницы, инфицированных патогенным микромицетом Fusarium oxysporum graminearum. С помощью метода молекулярной гибридизации mRNA с  si/mi RNA проверяли возможность индукции новыми биостимулянтами синтеза si/mi RNA с антипатогенной активностью. В исследованиях был использован метод дот-блот гибридизации mRNA  si/mi RNA. Результаты: Впервые показано, что новые биостимулянты Стимпо и Регоплант повышают устойчивость растений сахарной свеклы к нематодам Heterodera schchtii и растений яровой пшеницы к патогенному микромицету Fusarium oxysporum graminearum путем стимуляции биосинтеза малых регуляторных si/mi RNA.

Выводы: Установлено различие в популяциях si/mi RNA в контрольных растениях сахарной свеклы и яровой пшеницы и опытных растениях обработанных композиционными природными препаратами Стимпо и Регоплант – биостимулянтами с биозащитным эффектом на искусственно созданных инфекционных фонах с использованием нематод Heterodera schchtii, а также патогенными микромицетами Fusarium oxysporum graminearum. Результаты исследований указывают на существования чувствительной системы перепрограммирования генома клеток растений под действием внешних регуляторных факторов.

Ключевые слова: биостимулянты, малые регуляторные si/mi RNA, устойчивость растений к патогенам. 

 

Работа выполнена в рамках международного проекта Р-490 Украинского научно-технологического центра.

 

ВСТУПЛЕНИЕ: В течение последних 15 лет учеными многих стран уделяется внимание выделению из клеток эукариотов и изучению биологической роли малых регуляторных RNA (small regulatory RNA) в RNAі  (RNA interference) процессе, который принято называть пост-транскрипционный сайленсинг генов (PTGS) в растениях, животных и грибах [1-7]. Сайленсинг генов – процесс, в результате которого происходит деградация или блокирование трансляции молекул-мишеней mRNA, имеет большое значение в адаптационной резистентности к вирусам, в защите генома от транспозиций мобильных ДНК элементов, а также в онтогенетической регуляции экспрессии генов. Основную роль в сайленсинге исполняют 2 типа малых регуляторных RNA: miRNA (microRNA) и siRNA (short interfering RNA)  [1-6]. miRNA образуются из молекул предшественников путем двух раундов эндорибонуклеазного расщепления с помощью RNаse –III подобных ферментов: сначала с помощью рибонуклеазы  RNаse –III Drosha образуется pre-miRNA- первоначальный шпилько – подобный удлиненный (~70 нуклеотидов) транскрипт с одноцепочечных отдельных геномных локусов. Эти молекулы  pre-miRNA транспортируются в цитоплазму клетки, где происходит их процессинг с помощью эндорибонуклеазы  RNаse III Dicer, в результате чего образуются зрелые одноцепочечные (длиной ~21-22 нуклеотида) молекулы miRNA, которые инкорпорируются в miRNPs (micro-ribonucleoproteins) [3-4]. siRNA (размером ~21-24 нуклеотида) образуются из удлиненных двухцепочечных предшественников РНА – dsRNA (double –stranded siRNA) в результате их расщепления эндорибонуклеазой  RNаse III Dicer на короткие одноцепочечные (ss) siRNA (single-stranded siRNA)  [1,2,5,6]. Одна часть (ss) siRNA используется для «сайленгсирования» молекул –мишеней mRNA,  тогда как другие молекулы (ss) siRNA функционируют как праймеры к комплементарным последовательностям mRNA, на которых с помощью полимеразы RdRP (RNA –dependent RNA polymerase) образуются новые молекулы  dsRNA. Предполагают, что siRNA являются производными от удлиненных последовательностей, которые повторяются, транспозонов и трансгенов. Установлено, что si/mi RNA близки по структуре и функции (характеризуются антисенсовой комплементарной структурой к mRNA) и выполняют двойную роль в растениях [1-15]: 1) вместе с сайт-специфичными мульти-субединичными ендо-и экзонуклеазами, которые являются составляющими RISC комплекс (RNA – induced silencing complex),  si/miRNA определяют период жизни каждой из молекул mRNA, в первую очередь уничтожают путем деградации (расщепления), или блокирования (сайленсинга) трансляции аберрантные и несовершенные по структуре молекулы mRNA, которые могут появляться ошибочно в клетках; 2) выполняют защитные (антипатогенные и антипаразитарные) функции. В обоих случаях эти биологичные эффекты достигаются путем связывания si/miRNA с комплементарной полинуклеотидной частью mRNAсобственных клеток или mRNA болезнетворных вирусов, или  mRNA паразитических организмов, например нематод. В клетках животных и растений si/mi RNA функционируют различными путями: si/mi RNA с 3´-UTR участками (3´-untranslated regions) или с ORF (open reading frame) молекул мишеней mRNA, в то время как si/miRNA растений связываются с кодирующими последовательностями mRNA [16]. Но в случаях инфицирования большой массы клеток в тканях растений вредителями синтезируются недостаточно молекул  si/miRNA против тех или иных паразитов и поэтому, соответственно не достигается полный защитный эффект. Ученые предлагают 2 подхода повышения количества si/miRNA в ответ на патогенез [1, 5, 8-10]: с помощью введения в клетки дополнительного количества копий генов si/miRNA путем генетической трансформации; активации экспрессии собственно клеточных генов и синтеза si/miRNA какими либо специфическими индукторами.

            К новым эффективным препаратам созданным в Украине, относятся индукторы иммунозащитных свойств растений государственного предприятия «Межведомственный научно-технологический центр «Агробиотех» НАН и МОН Украины биостимулянты Стимпо и Регоплант, биозащитные свойства которых обусловлены синергическим эффектом взаимодействия продуктов жизнедеятельности в культуре in vitro грибами микромицетами, выделенными из корневой системы женьшеня (комплекс аминокислот, жирных кислот, органических кислот, полисахаридов, фитогормонов и микроэлементов), аверсектинов – комплексных антипаразитарных макролидных антибиотиков, продуктов метаболизма почвенного микромицета Streptomyces avermitilis  [17]. Стрептомицеты известны как продуценты не только антибиотиков, но и ряда других биологически активных соединений, которые проявляют биозащитный ростостимулирующий эффект  [18,19].

            В проведенных авторами молекулярно-генетических исследованиях [20,21] указанные поликомпонентные биостимулянты Стимпо и Регоплант значительно повышают устойчивость растений к различным патогенам благодаря стимуляции ими синтеза собственно клеточных малых регуляторных RNA(small regulatory RNA), которые берут участие в RNAi (RNA interference) процессе, который принято называть посттранскрипционным сайленсингом генов (PTGS)  у растений, животных и грибов [22-27].

Сайленсинг генов – процесс, в результате которого происходит или деградация или блокирование трансляций молекул – мишеней mRNA и имеет большое значение в адаптационной резистентности к вирусам, защите генома от транспозиций мобильных элементов ДНК, а также в онтогенетической регуляции экспрессии генов. Основную роль в сайленсинге выполняют малые регуляторные  si/miRNА размером 22-24 но [22-27], которые синтезируются из предшественников – двуцепочных dsRNA (double-stranded RNA) транскриптов путем эндонуклеазного расщепления с помощью RNAаза – ІІІ подобных ферментов. Вместе с сайт -специфическими  эндо-и экзонуклеазами si/miRNA или блокируют (сайленсингируют) трансляцию аберрантных и несовершенных по структуре собственных клеточных mRNA, а также mRNA патогенов и паразитов или ферментативно расщепляют эти молекулы – мишени  mRNA, что и приводит к их деградации [22-27].

            Целью данной работы было установление молекулярно-генетических механизмов повышения устойчивости растений сахарной свеклы и яровой пшеницы к патогенным организмам.

 

Материалы и методы

В опытах использовали растения сахарной свеклы Beta vulgaris L, инфицированные в лабораторных условиях цистообразующими корнепаразитирующими нематодами Heterodera schachtii, а также растения пшеницы, инфицированные патогенным микромицетом Fusarium oxysporum graminearum.

            С помощью метода молекулярной гибридизации  mRNA с si/miRNA проверяли возможность индукции биостимулянтами усиления биосинтеза si/miRNA с антинематодной активностью. С этой целью семена сахарной свеклы с высокой всхожестью проращивали в чашках Петри в водной среде без нематод (контроль) и с суспензией цист нематод, из которых в процессе инкубации при температуре 23ОС появлялись инфекционные личинки нематод  (приблизительно на 5-7 й день эксперимента). В параллельных пробах вносили композиционные препараты Стимпо, Регоплант, Биоген.

            Аналогичные эксперименты проводили при проращивании семян пшеницы для проверки антипатогенного действия малых регуляторных si/miRNA в зависимости от уровня их биосинтеза в клетках растений при проращивании семян яровой пшеницы необработанных биостимулянтами (контроль) и обработанные комплексными полифункциональными препаратами Стимпо, Регоплант, Биоген. Обработанные и контрольные  семена были пророщены в чашках Петри при температуре 25 ±0,5ОС и инфицированы патогенным микромицетом Fusarium oxysporum graminearum.

            Препараты si/miRNA высокой чистоты из опытных растений выделяли с помощью разработанного авторами метода [21], который состоит из следующих этапов: 1) выделение суммарного препарата RNA из клеток взятых в эксперимент растений [28-30]. Полимерность выделенных суммарных препаратов RNA анализировали с помощью электрофореза в 1,5 % геле агарозы в присутствии 7 М мочевины (гели окрашивали раствором этидиумбромида перед фотографированием фракций RNA в ультрафиолете); 2) далее провели разделение поли(А)+mRNA и поли(А)-mRNA на олиго(dT) –целлюлозной колонке; 3)осаждение высокомолекулярной фракции  поли(А)- mRNA проводили с помощью 10%-ого раствора полиэтиленгликоля (мол.масса 8000) с 0,5М NaCl, si/miRNA выделяли равным объемом 96% этанола при -22ОС в течении суток; с колонки поли(А)+mRNA снимали 2-3 объемами буферного раствора следующего состава: 10мМтрис-НС1(РН 7,5), 1 мМ ЕДТА, 0,05% ДДС –NA [31,32], а после элюции с колонки поли(А)+mRNA осаждали этанолом; 4) молекулярную гибридизацию низкомолекулярных si/miRNA с фракцией поли(А)+mRNA проводили в растворе 2хSSC; затем наносили гибридные молекулы поли(А)+mRNA с si/miRNA на олиго(dT) – целлюлозную колонку с последующей элюцией с колонки буфером указанным в п.3; 6) проводили денатурацию (при 95 ОС) очищенных с помощью колонки гибридных молекул поли(А)+mRNA с si/miRNA; 7)отделяли поли(А)+mRNA с si/miRNA с помощью метода фракционирования на олиго(dT) – целлюлозной колонке; 8)повторное осаждение si/miRNA проводили 96% этанолом с проверкой чистоты si/miRNA с помощью электрофореза в 15% полиакриломидном геле (ПААГ-электрофорез).

            Статистическую обработку полученных результатов проводили методом дисперсионного анализа.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И  ОБСУЖДЕНИЯ

 

В проведенных лабораторных опытах выявлено, что комплексные полифункциональные биостимулянты Регоплант и Стимпо значительно повышают устойчивость растений к воздействию опасных паразитов –нематод (цистообразующих и галловых) и патогенного гриба микромицета Fusarium. В опытах  in vitro получены результаты (морфо-физиологических показателей роста и развития проростков сахарной свеклы), что подтверждает высокую эффективность действия композиционных биостимулянтов на личинки цистообразующих нематод  Н. schachtii. На рис. 1 показаны фотографии полученные при выращивании на инфекционных фонах (в присутствии личинок Н. schachtii) 5-ти дневных проростках сахарной свеклы, полученных при обработке семян биостимулянтом Стимпо в концентрации 5 мкг/мл (А) и контрольным без биостимулянта (Б). Как можно увидеть, опытные проростки под влиянием Стимпо проявляют активный рост и развитие на инфекционном фоне, тогда как контрольные растения (без Стимпо) погибли на 5-й день проращивания. 

Рис. 1. 5-ти дневные проростки сахарной свеклы выращенные на инфекционном фоне (в присутствии личинок цистообразующих нематод  Н. schachtii):

А – опытные проростки с обработанных биостимулянтом Стимпо семян;

Б – проростки полученные из семян без обработки.

 

При постановке эксперимента по изучению молекулярно-генетических механизмов действия композиционных биостимулянтов с биозащитным эффектом, мы исходили из посылки, что угнетение растений различными типами патогенов или паразитов индуцирует синтез специфических к их структуре mRNA пул защитных si/miRNA, благодаря чему повышается иммунитет растений согласно обозначенному выше механизму действия si/miRNA. Таким образом, получение ответа на поставленные вопросы может способствовать созданию нового поколения биостимулянтов со свойствами избирательной активации синтеза si/miRNA к mRNA того или иного патогенна или паразита. 

 Результаты ПААГ – электрофореза приведены на рис. 2, свидетельствуют что выделенные из проростков сахарной свеклы препараты si/miRNA высокой чистоты имели размер 21-25 нуклеотидов, что соответствует классическим размерам этих типов малых RNA. 

Рис. 2. ПААГ – электрофорез si/miRNA из проростков сахарной свеклы. Маркерные полинуклеотиды (в цифрах показана длина нуклеотидов) и препараты  si/miRNA на дорожках геля (соответственно 1 и 2) были насыщенны этидиум бромидом; радиоавтограф 33Р меченных si/miRNA с геля (дорожка 3).

 

Результаты, приведенные в таблице 1 свидетельствуют о снижения уровня синтеза собственно клеточных si/miRNA при инфицировании растений сахарной свеклы и личинками нематод и, напротив, о значительном повышении синтеза антинематодных si/miRNA под влиянием композиционных биостимулянтов с биозащитными свойствами Стимпо и Регопланта, в следствии чего –уменьшается поражение растения нематодами.

В экспериментах с установлением механизма антипатогенного действия биостимулянтов мы учитывали полученные ранее данные в полевых условиях Уладово –Люлинецкой станции Института сахарной свеклы и энергетических культур НААН Украины на высоко инфицированных нематодами полях с превышением порога вредности в 23 раза  [17,20], а также данные Одесского селекционно –генетического института НААНУ  на зерновых культурах, где было показана усиление защитных свойств различных сортов пшеницы к патогенным микромицетам  Fusarium oxysporum graminearum и другим грибным болезням. В лабораторных условиях опытов с семенами яровой пшеницы сорта Гризо, обработанными биостимулянтами с биозащитными  свойствами Стимпо и Регоплант, Биоген были получены результаты, которые свидетельствуют о резком повышении устойчивости растений пшеницы (до 35-70%)  к патогенному микромицету Fusarium oxysporum graminearum. Методом дот-блот –гибридизации цитоплазматических mRNA (через кДНК) и определение ранее фитогормонального состава у контрольных и опытных растений [20] установлено, что повышение урожайности и устойчивости культур к вредителям и болезням под влиянием новых биостимулянтов с биозащитным эффектом связанных со значительными изменениями популяционных характеристик (наборов) mRNA и малых регуляторных si/miRNA, очевидно, что за счет выборочного переключения генов у соответствующих мультисемействах генов происходит и активизация генов устойчивости (табл. 2).

 

ВЫВОДЫ

С помощью методадот-блот –гибридизации впервые установлено популяционные различия в si/miRNA между контрольными проростками сахарной свеклы, семена которые обрабатывались композиционными биостимулянтами с биозащитными свойствами на искусственно созданных нематодами  Н. schachtii инфекционніх фонах.

Существенное изменение в популяционных характеристиках si/miRNA в проростках растений яровой пшеницы сорта Гризо выявлено при изучении процента гомологии si/miRNA к mRNA у взрослых растений, которые выращивались из семян, обработанных биостимулянтами с биозащитным эффектом неинфицированных и инфицированных патогенным микромицетом Fusarium oxysporum graminearum. При этом наблюдали наличие изменений зависимости от концентрации биостимулянтов, что предоставляет возможность разработки новых технологий.

Таблиця 1. Степень (%) отличий по уровню гибридизации популяций цитоплазматических 33РmRNA с гомологическими si/miRNA с растений сахарной свеклы, инфицированных нематодой Н. schachtii и обработанных полифункциональными композиционными биостимулянтами, относительно контрольных растений.

 

Название

 биостимулянта

 

Контроль

% аверсектинов к биостимулянтам

Варианты опытов

Растения обработанные биостимуляторами

Растения обработанные биостимуляторами + нематоды

Биоген (Эмистим С + аверсектины)

 

 

 

98*

0,2

96±0,54**(2%)

86±0,46**(12%)

2,5

94±0,72** (4%)

88±0,58** (10%)

5,0

91±0,66**(7%)

92±0,62**(6%)

Стимпо (Биолан + аверсектины)

0,2

97±0,58**(1%)

82±0,64**(16%)

2,5

93±0,84**(5%)

84±0,72**(14%)

5,0

92±0,62**(6%)

87±0,68**(11%)

Регоплант (Радостим + аверсектины)

0,2

94±0,38**(4%)

86±0,48**(12%)

2,5

92±0,73**(6%)

88±0,52**(10%)

5,0

88±0,68**(10%)

90±0,38**(8%)

*- наличие достоверных отклонений в контроле р<0,05, n=3; **- наличие достоверных отличий от контроля, р<0,05, n=3

 

Примечание: в качестве контроля использовали % гибридизации 33 Р  mRNA с гомологической si/miRNA с растений, которые не обрабатывались биостимулянтами и нематодами. Степень (%) отличий изучали с помощью метода дот-блот –гибридизации. В опытах использовали 7-дневные проростки сахарной свеклы; в опытные пробы (в чашке Петри) добавляли по 20 мкл раствора каждого из композиционных биостимулянтов. Практически все проростки сахарной свеклы обработанные цистами нематод, без внесения биостимулянтов проростки погибали на 5 -й день инкубации.

 

Таблица 2. Степень (%) отличий по уровню гибридизации популяций цитоплазматических 33РmRNA с гомологическими si/miRNA из проростков яровой пшеницы сорта Гризо, которые были выращенные из семян обработаны биостимулянтами и патогенным микромицетом Fusarium oxysporum graminearum, относительно контрольных одномесячных растений.

 

Название

 биостимулянта

 

Контроль

 

% аверсектинов к биостимулянтам

Варианты опытов

Растения обработанные биостимулянтами

Растения, инфицированные

Fusarium graminearum

и обработанные

биостимулянтами

Биоген (Эмистим С + аверсектины)

 

 

 

98*

0,2

95±0,54**(3%)

82±0,46**(18%)

2,5

92±0,72** (6%)

88±0,58** (10%)

5,0

91±0,66**(7%)

92±0,62**(6%)

Стимпо (Биолан + аверсектины)

0,2

97±0,58**(1%)

80±0,64**(18%)

2,5

93±0,84**(5%)

89±0,72**(9%)

5,0

90±0,62**(8%)

     90±0,68**(8%)

Регоплант (Радостим + аверсектины)

0,2

94±0,38**(4%)

86±0,48**(12%)

2,5

89±0,73**(9%)

90±0,52**(8%)

5,0

87±0,68**(11%)

92±0,38**(6%)

*- наличие достоверных отклонений в контроле р<0,05, n=3; **- наличие достоверных отличий от контроля, р<0,05, n=3

 

Примечание: В качестве контроля использовались 33 РmRNA с гомологическими si/miRNA с растений, не инфицированных патогенным микромицетом Fusarium oxysporum graminearum и не обработанных биостимулянтами. Степень (%) отличий изучали с помощью метода дот-блот –гибридизации. В опытах использовали выросшие (одномесячные) семена яровой пшеницы сорта Гризо, выращенные из семян без обработки и с обработкой биостимулянтами на инфекционном фоне микромицета Fusarium oxysporum graminearum.