Роль регуляторов роста в иммунно-защитных реакциях растений на болезни, вызванные патогенными организмами

О. В. Бабаянц¹, В. А. Цыганкова², С. П. Пономаренко³, А. І. Медков³.

¹ Селекционно-генетический институт - Национальный центр семеноводства и сортоизучения НААН Украины.

² Институт биоорганической химии и нефтехимии HAH Украины, ул. Мурманская, 1, Киев, e‑mail: Ця електронна адреса захищена від спам-ботів. вам потрібно увімкнути JavaScript, щоб побачити її. .

³ Государственное предприятие Межведомственный научно-технологический центр "Агробиотех" HAH и МОН Украины, Харьковское шоссе, 50, Киев.

Одной из главных проблем современного сельского хозяйства является создание высокоэффективных и экологически безопасных агротехнологий, которые способны поддерживать устойчивость агросистем и направлены на усиление использования биологической защиты растений от вредных организмов, а также способствуют улучшению качества урожая. По данным FAO (Организация по продовольствию и сельскому хозяйству) ООН, ежегодно мировые потери урожая продовольственных культур составляют приблизительно 20-25 %. К наиболее распространенным и опасным вредителям, поражающим такие важные для сельского хозяйства культуры, как пшеница, кукуруза, ячмень, соя, рапс, принадлежат стебельковая кукурузная бабочка, озимая совка, шведская муха, проволочники, акациевая огневка, клубеньковые долгоносики, соевая плодожорка и паутинный клещ, трипс, рапсовый цветоед, блошка, рапсовый билан, луговые клопы, тли. Не менее актуальной является проблема защиты растений от широко распространенных грибковых, бактериальных и вирусных заболеваний, таких как фузариоз, церкоспороз, аскохитоз, склеротиниоз, пероноспороз, вертициллезное увядание, мучнистая роса, бурая листовая ржавчина, бактериальный ожог, желтая мозаика сои и др. [1, 2]. Суммарные потери урожая сельскохозяйственных культур от болезней, вызванных разными патогенными организмами, достигают в Украине 50 %.

Одним из весомых негативов ведения хозяйства является нарушение научно обоснованных структур посевов. Нарушение севооборотов и чередования культур приводит к снижению общей культуры земледелия и дополнительному ухудшению фитосанитарного состояния полей.

Как важный элемент защитных мероприятий в мировом растениеводстве все чаще применяют препараты биологического происхождения. Создание таких препаратов - это результат использования новейших достижений микробиологии, микологии, биотехнологии, почвоведения и основ защиты растений. Как показывают многолетние исследования и широкое внедрение созданных на Государственном предприятии «Межведомственный научно-технологический центр «Агробиотех» НАН и МОН Украины новых регуляторов роста растений Биолан, Биосил, Радостим и композиционных полифункциональных препаратов Биоген, Стимпо и Регоплант с усиленным биозащитным эффектом и регуляторными свойствами, обусловленных синергическим эффектом взаимодействия продуктов жизнедеятельности (смеси аминокислот, углеводов, жирных кислот, полисахаридов, фитогормонов и микроэлементов) в культуре in vitro гриба-микромицета, извлеченного из корневой системы женьшеня, и аверсектинов - комплексных антипаразитарных макролидных антибиотиков, продуктов метаболизма почвенного стрептомицета Streptomyces avermitilis [1], эти препараты отвечают современным требованиям.

С помощью молекулярно-генетического анализа авторами было четко показано, что указанные позитивные эффекты вышеупомянутых РРР достигаются путем количественных и качественных изменений в экспрессии генов, что является следствием перепрограммирования генома клеток растений регуляторами роста [3-7]. Исследование особенности и последовательностей изменений таких генетических процессов стало приоритетным в наших фундаментальных исследованиях при создании новых перспективных РРР.

Как выявлено в проведенных нами молекулярно-генетических исследованиях [8], эти препараты значительно повышают устойчивость растений к разным патогенам благодаря стимуляции ими синтеза собственных клеточных малых регуляторных РНК (small regulatory RNA), принимающих участие в RNAi (RNA interference) процессе, который принято называть посттранскрипционным сайленсингом генов (PTGS) у растений, животных и грибов [9]. Сайленсинг генов - процесс, в результате которого происходит или деградация, или блокирование трансляции молекул-мишеней mRNA, которые имеют большое значение в адаптационной резистентности к вирусам, в защите генома против мобильных элементов ДНК, а также в онтогенетической регуляции экспрессии генов. Главное участие в сайленсинге принимают малые регуляторные si/miPHK размером 22-24 нт [9], синтезирующиеся из предшественников - двухцепочечных dsRNA (double-stranded RNA) транскрипта путем эндонуклеазного расщепления с помощью РНКаза-III подобных ферментов. Вместе с сайт-специфическими эндо- и экзонуклеазами si/miRNA или блокируют (сайленсингируют) трансляцию аберрантных и несовершенных по структуре собственных клеточных мРНК, а также мРНК патогена и паразитов, или ферментативно расщепляют эти молекулы-мишени мРНК, что и приводит к их деградации [10].

Целью нашей работы было определение возможности с помощью указанных композиционных препаратов создать усиление синтеза эндогенных малых регуляторных si/miRNA - как основных составляющих иммунной системы растений.

Материалы и методы исследований

В экспериментах по исследованию эффективности композиционных регуляторов роста растений применяли семена озимой пшеницы, ячменя, сои и кукурузы. Регуляторы роста Стимпо, Регоплант использовали для обработки семян озимой пшеницы, ячменя, кукурузы и сои, а Стимпо - для опрыскивания посевов озимой пшеницы и ячменя в фазе конец кущения, сои - в фазе бутонизации и кукурузы - в фазе 7-9 листьев.

Полевые опыты проводились в Селекционно-генетическом институте - Национальном центре семеноведения и сортоизучения (далее - СГИ-НЦНС) в отделе фитопатологии и энтомологии при дополнительном техническом содействии Научно-производственной фирмы "Фунги" в полевых инфекционных рассадниках на искусственных инвазионных фонах и на природном фоне инвазии в течение 2010-2011 гг. Второй опытный полигон был в ДПДГ "Покровское" Беляевского района Одесской области. Участки площадью 10-30 м², учетных растений - 25 шт., повторность - 4-кратная, полная рендомизация с частым контролем (без препаратов). Использовали сорт озимой пшеницы - Дальницкая, сорт сои - Аркадия одесская, гибрид кукурузы - Кобза МВ.

 Норма высева – 4,5 млн. семян/га. Срок посева - 27.09.2010 г. Почвы опытного поля СП - южные черноземы, содержимое гумуса - 3,2 %. Общая сумма осадков за период сентябрь 2010 г. - июнь 2011 г. – 521,8 мм. Почвы полигона Покровского - южные малогумусные черноземы. Содержимое гумуса - 3,8 %. Общая сумма осадков за аналогичный период - 489,9 мм.

На полигонах сравнивали действие рострегуляторов на выносливость, урожайность, качество полученных семян, влияние на развитие инфекции и т. п.

Опыты проводили на искусственных инфекционных фонах головневых болезней: для сортов пшеницы Лузановка - рассадник твердой головни Tilletia caries, Русалка - рассадник летучей головни Ustilago tritici, для сорта ячменя Росава - рассадник твердой головни Ustilago hordei, летучей головни Ustilago nuda, черной головни Ustilago nigra.

Эффективность против твердой головни изучалась на разных по интенсивности фонах - при слабой заспоренности, то есть 0,1 г спор на 1 кг семян, и при высокой заспоренности, то есть 1 г спор на 1 кг семян.

Результаты и их обсуждение

В селекционно-генетическом институте Национального центра семеноведения и сортоизучения НААН Украины с 2003 года проводятся широкие испытания РРР производства ДП МНТЦ "Агробиотех". Исследования проводятся на полях СГИ-НЦНС, в полевых инфекционных рассадниках и в производственных условиях сельскохозяйственных предприятий Одесской обл. Основным заданием является исследование влияния новых регуляторов роста на посевные качества семян, урожайность, устойчивость к фитопатогену селекционо созданных в институте сортов озимой и яровой пшеницы, озимого и ярового ячменя, сои, кукурузы. В результате проведенных исследований установлено, что обработка препаратами Биолан, Радостим, Биосил приводит к повышению энергии прорастания и всхожести семян озимой пшеницы (табл. 1).

Таблица 1. Влияние регуляторов роста на всхожесть, урожайность и инфицированность фитопатогеном (озимая мягкая пшеница, сорт Оксана, инфекционный фон 2008 год)

В процессе вегетации растений было отмечено, что уровень поражения мучнистой росой и бурой листвою ржавчиной растений пшеницы не превышал 10-15 %, тогда как в контрольном варианте растения были заражены на 25 % мучнистой росой и на 35 % бурой листовой ржавчиной. Поражение фузариозом и септориозом на опытных участках с использованием РРР отмечено достоверно меньше, чем в контроле (2-5 % и 18 % соответственно). Отмечены значительные достоверные прибавки урожая по сравнению с контролем.

Большого внимания заслуживают результаты испытаний в производственных условиях. Установлено, что все препараты значительно повышают урожай яровой и озимой пшеницы, ярового и озимого ячменя. Лабораторными анализами подтверждено, что на фоне применения регуляторов роста повышаются все технологические показатели. Наиболее эффективными оказались соединения протравителя, регулятора роста и инсектицида в определенных соотношениях.

Установлено, что препараты Биолан, Радостим, Биосил проявляют уникальные комплексные свойства: повышают урожай растений и его качество, усиливают иммунитет растений к болезням, раскрывают биологический потенциал сорта. Более того, зерно, полученное в вариантах с применением регуляторов роста, практически не содержит микотоксинов и остаточных количеств пестицидов, то есть претендует на экологически безопасную продукцию.

Важную роль в системе земледелия играют созданный сорт или гибрид, которые должны иметь унаследованную генетическую устойчивость к фитопаразиту и болезням. Применение новых регуляторов роста способствует раскрытию потенциала сорта и активизации экспрессии генов устойчивости.

Многие годы ученые фитопатологи, вирусологи, энтомологи ищут надежный путь в борьбе с вирусными инфекциями выращиваемых зерновых колосовых культур. Наиболее надежным способом является создание устойчивых и толерантных к вирусам и их носителям сортов. Однако этот путь достаточно долгий и не всегда может быть успешным. Доказано, что к наиболее вредному вирусу - вирусу желтой карликовости ячменя, который может привести к потере 60 % урожая озимой пшеницы, отсутствует генетически закрепленная устойчивость, и поэтому необходим поиск другого способа решения проблемы. Мы разработали схему применения в предпосевном коктейле для обработки семян композицию наиболее эффективных и экологически безопасных фунгицидов, инсектицидов и регулирующих рост препаратов. Таким образом, мы получили при применении композиций регулятора Биолан в смеси с фунгоинсектицидными протравителями максимальный противовирусный эффект со значительным повышением урожая, который открывает новые возможности в технологиях выращивания зерновых колосовых культур.

В серии экспериментов с препаратами Биолан (20 мл/га), Биосил (20 мл/га), Радостим (50 мл/га) мы обрабатывали пшеницу в разные сроки вегетации, а именно в фазе кущения, фазе выхода в трубку, во время цветения. Обработку проводили в разных вариантах: одноразовая - в фазе кущения, двукратная (выход в трубку и колошение) и трехкратная (выход в трубку, колошение, цветение-колошение).

В качестве контроля проводили обработку высокоэффективным фунгицидом Фалькон (Германия, Bayer Crop Science FG) в вариантах, аналогичных таковым в экспериментах с регуляторами роста. Оказалось, что применение регуляторов роста трижды в течение вегетации имеет высокую эффективность защитного действия. На уровне одноразовой, а в ряде опытов двукратной обработки фунгицидом существенно снижается общее повреждение листостебельными заболеваниями, уменьшается количество поврежденного фузариями и альтернарией зерна в колосьях, соответственно повышается урожай. При высокой степени поражения патогеном одноразовое применение регуляторов роста, безусловно, не может повлиять на результат. Однако, урожайность даже в этом случае повышается. Это указывает на то, что регуляторы роста влияют на растения как иммуномодуляторы, то есть даже при наличии развития болезни растение в состоянии вегетировать и быть физиологически полноценным. При подсчете экономического эффекта признано, что трехкратная обработка фунгицидами достаточно затратная для хозяйства, потому трехкратная обработка регуляторами роста имеет значительные преимущества, как экономические, так и экологические в получении качественного зерна и продуктов его переработки. 

В течение 2010-2012 гг. нами были проведены исследования активности применения новых регуляторов роста растений с биозащитным эффектом на инфицированных фонах выращивания озимой пшеницы, ячменя, сои, кукурузы, в сравнении с современными пестицидами ведущих фирм "Bayer Crop Science FG, Германия", фунгицид Yunta Quadro, фунгицид Lamardor, инсектицид Alpha-cypermethrin, "Syngenta" Швейцария, инсектицид Selest Top, Terios, Microplant. Полученные нами результаты представлены в табл. 2. Можно видеть, что в условиях обработки кондиционных семян регуляторами роста отмечено позитивное действие на все физиологичные показатели растений (табл. 2.). Действительно, влияние на ростовые процессы, на элементы структуры урожая, на урожайность является достаточно существенным относительно контрольного варианта. Высшая позитивная динамика выявлена при применении Стимпо и Регопланта - новейших инновационных препаратов, которые проходят предрегистрационные испытания.

В варианте вегетационного опрыскивания посевов препаратом Стимпо выявлено позитивное влияние препарата на все физиологичные показатели. Наблюдается достоверная прибавка к урожаю.

Наилучшие показатели выявлены в варианте, когда РРР используются дважды - в момент предпосевной обработки семян и опрыскивания посевов во время вегетации. Показано, что препараты с биозащитным эффектом Стимпо и Регоплант способствовали дополнительной сохранности урожая почти на 60 % относительно контроля. Другие препараты тоже проявили высокую эффективность.

Таблица 2 

 РРР и их влияние на урожайность и элементы структуры урожая 

Использование РРР в борьбе с разными типами традиционных инфекций является целесообразным при применении их совместно с высококачественными оригинальными химическими препаратами. Регуляторы роста обезвреживают фитотоксичность химических протравителей, а у растений стимулируют иммунные реакции, в результате чего происходит оздоровление как товарной продукции, так и семенного материала.

При изучении действия РРР на вредную фауну семян (нематоды, турун хлебный, совки, злаковые мухи) определено, что их биозащитный эффект является достаточно высоким (табл. 3). Хотя превзойти эффект, который выявляют такие фунго-инсектициды, как Юнта Квадро и Селест Топ не удается, однако уровень эффективности, который нами отмечен при применении препаратов Регоплант - против пшеничной нематоды, Регоплант - против туруна, Регоплант - против совки, а также всех исследуемых РРР - против злаковых мух, является значительным, экономически и экологически выгодным. Поэтому мы считаем перспективным использование препаратов Регоплант и Стимпо для предотвращения развития, распространения и вредности почвенных вредителей и, в некоторой степени, сосущих вредителей.

Таблица 3 

Эффективность РРР с биозащитным эффектом по сравнению с традиционными химическими препаратами - протравителями семян против нематоды пшеничной, туруна, совки озимой, злаковых мух (2011 г.) 

 Примечание:

Опыт лабораторный, в ограниченном пространстве 25 см х 25 см. Повторность 4-кратная. Почва заселялась отдельно нематодой, туруном, совкой озимой. Сорт озимой пшеницы Дальницкая. Семена в ящик высевались после обработки определенным препаратом. Учетных растений - 50.

1 - Количество поврежденных проростков, шт./м²

2 - Биологическая эффективность, %

Регоплант и Стимпо проявляли также антипатогенную активность против возбудителей гнили и плесени (табл. 4). Однако, использование этих препаратов в качестве альтернативы химическими протравителям мы не считаем целесообразным, особенно при условиях наличия высокого инфекционного фона той или другой болезни. При наличии невысоких инфекционных фонов применять регуляторы роста вполне возможно, учитывая уровень их потенциальной эффективности.

Таблица 4

Эффективность РРР по сравнению с другими препаратами - протравителями семян против возбудителей гнили и плесени пшеницы (сорт Одесская полукарликовая, 2011 г.)

Примечание:

Опыт проводился в лабораторных условиях на искусственно инфицированных определенным патогеном семенах сорта Одесская полукарликовая.

1 - Количество инфицированных зерновок;

2 - Биологическая эффективность, %.

* грибы Mucor spp., Rhizopus spp., Aspergillus spp., Pйnicillium spp., Trichothecium roseum.

** возбудители бактериальной гнили

Впервые в Украине нами исследовано также влияние регуляторов роста на вегетацию сои и кукурузы. Показано, что препараты Регоплант и Стимпо положительно влияют на ростовые процессы растений сои (табл. 5) и кукурузы (табл. 6).

Таблица 5

РРР и их влияние на урожайность и элементы структуры урожая сои

Таблица 6

 РРР и их влияние на урожайность и элементы структуры урожая кукурузы 

Исследуя влияние Регопланта и Стимпо на развитие болезней сои и сравнивая эффективность этих препаратов с химическими протравителями, мы установили, что при искусственном инфицировании сои опасным патогеном семян эффективность испытуемых РРР оказывается достаточной. То есть при условиях использования этих препаратов в качестве протравителей можно ожидать позитивное влияние на оздоровление семян сои (табл. 7).

Таблица 7 

Эффективность РРР по сравнению с другими препаратами - протравителей семян против возбудителей гнили и плесени сои, 2011 г. 

        Примечание:

Опыт лабораторный. Семена сои искусственно инфицированы возбудителями наиболее экономически значимых и вредных болезней сои. После чего семена в опытных вариантах обрабатывались выше названными препаратами. Сорт сои - Аркадия одесская.

1 - Количество инфицированных зерновок;

2 - Биологическая эффективность, %

* грибы Mucor spp., Rhizopus spp., Aspergillus spp., Pйnicillium spp.,Trichothecium roseum. 

В опытах относительно влияния регуляторов роста Регоплан и Стимпо на уменьшение влияния инфекции и на ростовые процессы семенного материала мы установили, что РРР положительно влияют на рост и развитие семян кукурузы. Они снижают влияние инфекции на развитие семян, снимают инфекционную нагрузку на товарное зерно, и т. п. (табл. 8). Считаем перспективным использование Регопланта и Стимпо в технологии выращивания кукурузы в хорошо развитых хозяйствах Украины.

Таблица 8

Эффективность РРР по сравнению с другими препаратами - протравителями семян против возбудителей гнили и плесени кукурузы, 2011 г. 

Примечание:

Семена кукурузы гибрида Кобза MB было искусственно инфицированы возбудителями наиболее экономически значимых и вредных болезней культуры. После чего семена в опытных вариантах обрабатывались выше указанными препаратами.

1 - Количество инфицированных зерновок;

2 - Биологическая эффективность, %

* - грибы Mucor spp., Rhizopus spp., Aspergillus spp., Pinicillium spp.,Trichothecium roseum 

В опытах in vivo нами был исследован также эффект последействия регуляторов роста (то есть наследование устойчивости растений к вредителям). В экспериментах с семенами, полученными из ряда видов растений, которые были обработаны в процессе вегетации регуляторами роста (1-е поколение) установлено, что и во втором поколении растения, которые уже не обрабатывались регуляторами роста, хранят высокую жизнеспособность и производительность, близкие к тем, которые были получены у растений 1-го поколения.

Молекулярно-генетический анализ цитоплазматических мРНК растений первого и второго поколения методом ДОТ-блоттинга показал высокую степень гомологии между мРНК растений 1-го и 2-го поколения и более низкую степень гомологии к мРНК контрольных растений. Этот эффект нами назван "квазигетерозисом". Также на ряде культур установлено, что регуляторы Биолан, Биосил, Стимпо существенно усиливают ростовые возможности и производительность гетерозисных растений.

В проведенных нами молекулярно-генетических исследованиях установлено, что основной механизм действия вышеуказанных регуляторов роста в клетках растений заключается в усилении синтеза (копийности) малых регуляторных РНК (dsRNA) почти вдвое, которые выявляют антипатогенные и антипаразитарные свойства (например, антинематодные). 

Выводы

Таким образом, по результатам проведенных в полевых и лабораторных условиях испытаний регуляторов роста Регоплант и Стимпо мы считаем целесообразным рекомендовать эти препараты для регистрации с целью их использования в Украине на зерновых колосовых культурах.